Isolement d'ADN chez Synechocystis
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Isolement d'ADN chez Synechocystis

L'isolement de l'ADN total de Synechocystis sp. PCC 6803 est effectué selon la méthode décrite par Franche und Damerval (1988). Les cyanobactéries sont centrifugées (4000 x g, 10 min) en phase logarythmique de croissance. Le sédiment de 250 ml de culture est ensuite lavé à l'aide de 5 ml de tampon TE, repris dans 5 ml de tampon Saccharose et congelé dans de l'azote liquide.

Tampon TE: 10 mM Tris/HCl pH 7,0
  1 mM EDTA, pH 8,0

Tampon Saccharose: 25% w/v Saccharose
  50 mM Tris/HCl pH 7,0
  100 mM EDTA, pH 8,0


Le culot est laissé décongéler une heure à 37°C dans une solution ph 8 contenant 5 mg/ml de Lysozyme et 100 mM d'EDTA. A la solution sont ensuite ajoutés la Proteinase K (100 µg/ml) et du SDS (concentration finale 2%) puis l'incubation se fait à 37°C toute la nuit.

Le lendemain, le lysat cellulaire est extrait en utilisant par 2 fois un volume équivalent de Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1). Dans chacune des centrifugations (4000 x g; 10 min) qui s'ensuivent, une séparation de phase s'opère. La phase aqueuse résultante est traitée par un volume du mélange Chloroform/Isoamylalkohol et à nouveau centrifugée 10 min. à 4000 x g.

La précipitation de l'ADN est ensuite effectuée grace à l'ajout de 0,7 volume d'isopropanol, à l'incubation de la solution 30 min puis à sa centrigation à 12000xg. Il s'ensuit une étape de lavage avec de l'éthanol 70% et un séchage sous vakuum. Le culot d'ADN est ensuite dilué dans 100-500 µl d'eau distillée. aufgenommen.